維生素A和維生素E的測(cè)定方法（HPLC） 
 1.原理
食物中的維生素A及維生素E經(jīng)皂化提取以后，將其不可皂化的部分提取到有機(jī)溶劑中。用HPLC法測(cè)定維生素A及維生素E的含量。

2.適用范圍
GB12388-90 本法適用于各種食物和飼料的測(cè)定
3. 儀器
（1） 高壓液相色譜儀（帶紫外檢測(cè)器）
（2） 六孔恒溫水浴鍋
（3） 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器
（4） 高純氮?dú)?br /> （5） 高速離心機(jī)
4. 試劑
本實(shí)驗(yàn)所用試劑皆為分析純，所用水皆為蒸餾水
4.1無(wú)水乙醇：重蒸，不含有醛類(lèi)物質(zhì)
檢查方法：取2ml銀氨溶液于試管中，加入少量乙醇，搖勻，再加入10%氫氧化鈉溶液，加熱，放置冷卻后，若有銀鏡反應(yīng)則表示乙醇中有醛。
脫醛方法：取2g硝酸銀溶于少量水中。取4g氫氧化鈉溶于溫乙醇中。將兩者傾入1L乙醇中，振搖后，放置暗處兩天（不時(shí)搖動(dòng)，促進(jìn)反應(yīng)），經(jīng)過(guò)濾，置蒸餾瓶蒸餾，棄去初蒸出的50ml。當(dāng)乙醇中：
4.2 10%抗壞血酸溶液（Vc） W/V 臨用前配制
4.3 50%氫氧化鉀溶液（KOH） W/V
4.4 無(wú)水乙醚 重蒸，不含過(guò)氧化物
4.4.1過(guò)氧化物檢查方法：用5ml乙醚加1ml10%碘化鉀溶液，振搖1min，如有過(guò)氧化物則放出游離碘，水層呈黃色或加4滴0.5%淀粉液，水層呈藍(lán)色。該乙醚需處理后使用。
4.4.2 去除過(guò)氧化物的方法：重蒸乙醚時(shí)，瓶中放入鐵絲或鐵末少許。棄去10%初餾液和10%殘餾液。
4.5 pH 1-14試紙
4.6 無(wú)水硫酸鈉 Na2SO4
4.7 甲醇 色譜純或分析純重蒸后使用
4.8 重蒸水 蒸餾水中加入少量高錳酸鉀重蒸后使用
4.9 苯并〔e〕芘標(biāo)準(zhǔn)液 稱(chēng)取苯并〔e〕芘（純度98%），用脫醛乙醇配制成1ml相當(dāng)于5μg苯并〔e〕芘的內(nèi)標(biāo)溶液。
4.10維生素A標(biāo)準(zhǔn)液 視黃醇（純度85%Sigma公司）用脫醛乙醇溶解維生素A標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為1ml相當(dāng)于1mg視黃醇。臨用前用紫外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。維生素E標(biāo)準(zhǔn)液α-生育酚（純度95% Sigma公司），δ-生育酚（純度95% Sigma公司），δ-生育酚（純度95%Sigma公司）。用脫醛乙醇分別溶解以上三種維生素E標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為1ml相當(dāng)于1mg。臨用前用紫外分光光度法分別標(biāo)定此三種維生素E的準(zhǔn)確濃度。

5.操作步驟
本實(shí)驗(yàn)需避光操作
樣品皂化 稱(chēng)取樣品于三角瓶中，加30ml無(wú)水乙醇，振搖三角瓶，使樣品分散均勻。加入5ml10%抗壞血酸和苯并〔e〕芘標(biāo)準(zhǔn)液2ml，混勻。最后加入10ml氫氧化鉀邊加邊振搖。于沸水浴上回流30min使樣品皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷卻。
樣品萃取將皂化后的樣品移入分液漏斗中，用50ml水分2次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100ml無(wú)水乙醚分兩次洗皂化瓶及殘?jiān)?，乙醚液并入分液漏斗中。輕輕振搖分液漏斗2min，靜置分層，棄去水層。然后每次用約100ml水將乙醚液洗至中性，約4-5次。
濃縮 將乙醚提取液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉（約5g）濾入150ml旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，用約15ml乙醚沖洗分液漏斗及無(wú)水硫酸鈉2次，并入蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，并將其接在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，于55℃水浴中減壓蒸餾并回收乙醚，待瓶中乙醚剩下約2ml時(shí)，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮?dú)鈱⒁颐汛蹈?。加?ml乙醇溶液，充分混合，溶解提取物。將乙醇液移入塑料離心管中，于離心機(jī)上以3000轉(zhuǎn)/min離心5分鐘。上清液供色譜分析。
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備將維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)品配置成標(biāo)準(zhǔn)溶液（約1mg/ml），制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)前用紫外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)定方法取維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)液若干微升，分別稀釋至10.00ml乙醇中，并分別按給定波長(zhǎng)測(cè)定各維生素的吸光值。用比吸光系數(shù)計(jì)算該維生素的濃度。測(cè)定條件如下  標(biāo)     準(zhǔn)
 比吸光系數(shù)E1%cm
 波    長(zhǎng) λ，nm
 
  視黃醇
      1835
      325
 
 α—生育酚
       71
      294
 
 γ—生育酚
       92.8
      298
 
 δ—生育酚
       91.2
      298
 

濃度計(jì)算：
X1= A/E×1/100×10.00/S×10-3
式中 X1：某維生素濃度，mg/ml；
A：維生素的平均紫外吸光值；
S：加入標(biāo)準(zhǔn)的量，μl；
E：某種維生素1%比吸光系數(shù)；
10.00/S×10-3 ：標(biāo)準(zhǔn)液稀釋倍數(shù)。
本法采用內(nèi)標(biāo)兩點(diǎn)法進(jìn)行定量。把一定量的維生素A、維生素E及內(nèi)標(biāo)苯并〔e〕芘液混合均勻，選擇合適的靈敏度，使上述物質(zhì)的各峰高約為滿(mǎn)量程的70%，作為高濃度點(diǎn)，高濃度的1/2為低濃度點(diǎn)（內(nèi)標(biāo)苯并〔e〕芘的濃度值不變），用此二種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行色譜分析。根據(jù)微處理機(jī)裝置，按說(shuō)明用二點(diǎn)內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。
液相色譜分析
儀器所需條件
預(yù)柱：ODS 10μm，4mm×4.5cm。
分析柱：ODS 5μm，4.6mm×25cm。
流動(dòng)相：甲醇：水=98：2?；靹颍R用前脫氣。
紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：300nm。量程0.02。
進(jìn)樣量：20μl進(jìn)樣定量環(huán)。
流速：1.65-1.70ml/min。

6.計(jì)算
X=C/m×V×100/1000
X：某種維生素的含量，mg/100g；
C：由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查到某種維生素含量，μg/ml；
V：樣品濃縮定容體積，ml；
m：樣品質(zhì)量，g；
用微處理機(jī)二點(diǎn)內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算時(shí)，按計(jì)算公式計(jì)算或由微機(jī)直
接給出結(jié)果。

7.注意事項(xiàng)
（1） 維生素A極易被破壞，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在微弱光線(xiàn)下進(jìn)行，或用棕色玻璃儀器。
（2） 在皂化過(guò)程中，應(yīng)每5分鐘搖一下皂化瓶，使樣品皂化完全。
（3） 提取過(guò)程中，振搖不應(yīng)太劇烈，避免溶液乳化而不易分層。
（4） 洗滌時(shí)，最初水洗輕搖，逐次振搖強(qiáng)度可增加。
（5） 無(wú)水硫酸鈉如有結(jié)塊，應(yīng)烘干后使用。
（6） 在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)，乙醚溶液不應(yīng)蒸干，以免被測(cè)樣品含量有損失。
（7） 用高純氮吹干時(shí)，氮?dú)獠荒荛_(kāi)的太大，避免樣品吹出瓶外結(jié)果偏低。