水產品中孔雀石綠殘留量的測定 液相色譜法
SC/T 3021—2004
發(fā)布單位：中華人民共和國農業(yè)部
1、范圍
    本標準規(guī)定了水產品中孔雀石綠和無色孔雀石綠殘留量的液相色譜測定方法。
    本標準適用于水產品可食部分中孔雀石綠和無色孔雀石綠殘留量的檢測。
2、規(guī)范性引用文件
    下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。
    GB/T 6682  分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
3、術語和定義
    下列術語和定義適用于本標準。
3.1
    孔雀石綠malachite green
    屬于三苯甲烷染料類，分子式為C23H25ClN2，綠色結晶體。
    注：孔雀石綠的結構式見附錄A。
3.2
無色孔雀石綠  leucomalachite green
    N，N—二甲基苯胺，孔雀石綠在水生生物體中的主要代謝產物，分子式為C23H26N2 。
    注：無色孔雀石綠的結構式見附錄A。
4、原理
    以乙酸胺鹽溶液和乙腈提取樣品中的孔雀石綠和無色孔雀石綠后，經過液一液萃取，固相萃取，用接有氧化柱的C18柱進行高效液相色譜分析，外標法定量。
5、試劑
5.1  所有試劑應無干擾峰，應選擇優(yōu)級純或色譜純的試劑，分析純試劑應重蒸。
5.2  孔雀石綠及無色孔雀石綠標準品：孔雀石綠純度≥90％，無色孔雀石綠純度≥90％。
5.3  乙腈：色譜純。
5.4  二氯甲烷：分析純。
5.5鹽酸羥胺溶液：0.25g/mL。
5.6二甘醇：分析純。
5.7  乙酸銨溶液：0.1mol/L(pH4.5)，0.125mol/L(pH4.5)。
5.8  對甲苯磺酸溶液：0.05mol/L。
5.9  堿性氧化鋁：分析純，粒度0.071mm～0.1501nrn。
5.10  中性氧化鋁：分析純，粒度0.07mm～0.150mm。
5.11  丙基磺酸陽離子樹脂：PRS(propylsulfonic acid)，40μm。
5.12  孔雀石綠標準溶液：準確稱取孔雀石綠0.100 0g，用乙腈溶解，定容于100mL容量瓶中，使成濃度為1mg/mL的標準溶液，再用乙腈稀釋成0.1lμg/mL的工作溶液。該溶液應避光保存。
5.13  無色孔雀石綠標準溶液：準確稱取無色孔雀石綠0.100 0g，用乙腈溶解，定容于100mL容量瓶中，使成濃度為1mg/mL的標準溶液，再用乙腈稀釋成0.1μg/mL的工作溶液。該溶液應避光保存。
5.14二氧化鉛：分析純。
5.15  硅藻土：精制工業(yè)硅藻土。   
5.16  水：應符合GB/T 6682的要求。
6、儀器
6.1  高效液相色譜儀：配可變波長檢測器。
6.2  電子天平：感量0.0001g。
6.3  勻漿機。
6.4  離心機。
6.5  振蕩器。
6.6 旋轉蒸發(fā)器。
6.7  固相萃取柱：PRS柱，中性氧化鋁柱。
6.8 色譜柱:C18柱。
6.9  柱后氧化柱:柱內填料:二氧化鉛:硅藻土=1∶
7、操作方法
7.1  樣品處理
7.1.1  取樣
    魚去鱗、皮，沿背脊取肌肉；蝦去頭、殼，取可食肌肉部分；蟹、甲魚等取可食部分。所取樣品切為不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小、塊后混勻。
7.1.2  稱取樣品10g～20g(精確到0．001g)，置于勻漿杯中，向杯中依次加3mL鹽酸羥胺溶液、5mL對甲苯磺酸溶液和20mL 0.1mol/L的乙酸銨溶液，勻漿2min，轉移到250mL三角瓶中，用60mL乙腈洗滌勻漿杯，洗滌液合并到三角瓶中，加入20g堿性氧化鋁，用振蕩器振蕩5min，轉移至4支50mL離心管內，30mL乙腈洗滌三角瓶后轉移到離心管中，4 000r/min離心15min。
7.2  分離純化
7.2.1  液一液萃取
7.2.1.1  將離心管上清液移入分液漏斗中，向離心管中加入乙腈，洗滌，離心(4 000r/min，15min)，合并上清液到分液漏斗中，并加入100mL水、50mL二氯甲烷和2mL二甘醇，劇烈振搖分液漏斗，靜置1 h。
7.2.1.2  用蒸發(fā)瓶收集下層液體后，再往分液漏斗加入50mL二氯甲烷，振搖，靜置約10min，待其分層后收集下層液體于同一蒸發(fā)瓶。將收集液在35℃下減壓旋轉蒸發(fā)(注意：開始時溫度不要直接升到35℃，以免爆沸)至體積約2mL～3mL。
7.2.2  固相柱萃取
7.2.2.1  固相柱制備
    采用中性氧化鋁(1g)、PRS填料(0.5g)分別裝填兩只固相萃取柱，按中性氧化鋁柱在前、PRS柱在后的順序將兩柱串聯(lián)。
7.2.2.2  上樣
     使用前用5mL乙腈預洗兩柱，然后將7.2.1.2濃縮液體加入5mL乙腈混勻后，緩慢加入中性氧化鋁柱內(注意：不要引起柱表面填料浮動。)再用5mL乙腈洗滌蒸發(fā)瓶兩次，兩次洗滌液均加入柱內，最后用5mL乙腈洗滌兩柱。
7.2.2.3  洗脫收集
    棄去中性氧化鋁柱，用2mL水洗PRS柱，洗脫液棄去；加入0.5mL乙腈：乙酸銨溶液(0.1mol/L，pH4.5)=1∶1，洗脫液棄去；再加人2mL乙腈：乙酸銨溶液(0.1mol/L，pH4.5)＝1∶1，收集該洗脫組分，定容到2mL，經聚四氟乙烯膜(孔徑0.45um)過濾，待上機分析。
7.3  樣品測定
7.3.1  測定條件
7.3.1.1  色譜柱：C18柱，250mm×4.6mm；柱后氧化柱:35mm×4.6mm。
7.3.1.2  流動相：乙腈:乙酸銨溶液(0.125mol/L，pH4.5)=80∶20；流速：2mL/min。
7.3.1.3  柱溫：35℃。
7.3.1.4  進樣量：50μL。
7.3.1.5 檢測波長：588nm或618nm。
7.3.2  色譜分析
分別注入50μL濃度為0.1μg/mL的孔雀石綠溶液、無色孔雀石綠工作溶液及樣品提取溶液于液相色譜儀中，按上述色譜條件進行色譜分析，記錄峰面積，響應值均應在儀器檢測的線性范圍之內。根據標準樣品的保留時間定性，外標法定量。標準品色譜圖見附錄B。
8、結果
8.1  計算
    樣品中孔雀石綠、無色孔雀石綠的含量按公式(1)計算。
X=  A×Cs×V   ……………………………………………………………(1)
   As×m×1000
式中：
    X——樣品中孔雀石綠(無色孔雀石綠)含量，單位為微克每千克(μg/kg)；
    Cs——標準溶液中孔雀石綠(無色孔雀石綠)含量，單位為微克每毫升(μg/mL)；
    A ——試樣液中孔雀石綠(無色孔雀石綠)的峰面積；
    V——樣品提取物溶液體積，單位為毫升(mL)；
　　As——標準溶液中孔雀石綠(無色孔雀石綠)的峰面積；
    m——樣品重量，單位為克(g)。
8.2  方法回收率
    本方法的回收率≥70％。
8.3  方法檢測限
    本方法檢測限：孔雀石綠為2μg/kg；無色孔雀石綠為4μg/kg。
8.4  批間方法變異系數(shù)
    本方法變異系數(shù)≤15％。
8.5  方法的線性范圍
本方法的線性范圍：孔雀石綠標準液0.01 μg/mL～0.40 μg/mL；無色孔雀石綠標準液0.02μg/mL～0.40μg/mL。