乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的檢測(cè)方案
  

近日，蒙牛純牛奶被檢測(cè)出強(qiáng)致癌物——黃曲霉毒素M1，消息一出頓時(shí)又掀起一股食品安全隱患的討論。相比之前的三聚氰胺，黃曲霉素是否更難檢測(cè)？
現(xiàn)整理出全套的專業(yè)檢測(cè)方案，讓乳和乳制品中黃曲霉毒素M1無處躲藏。
1. 試用范圍
牛奶，奶粉，發(fā)酵乳，干酪，奶油等乳制品
2. 方法原理
黃曲霉毒素M1易溶于極性溶劑，因此均勻基質(zhì)中的黃曲霉毒素M1可以通過甲醇/水震蕩分散提取，對(duì)于高脂肪/油含量的樣品基質(zhì)加入正己烷予以脫脂。本方法采用免疫親和柱凈化，熒光檢測(cè)器測(cè)定乳制品中黃曲霉毒素M1。
3. 所需設(shè)備和耗材
黃曲霉毒素免疫親和柱：Welchrom? IAC (1ml，25支/盒；3ml，15支/盒)（上海本昂提供）；
高效液相裝置帶熒光檢測(cè)器；
均質(zhì)機(jī)；
水平振蕩器；
SPE轉(zhuǎn)接頭及50ml大容量上樣器：Welchrom? SPE Adapter（上海本昂提供）；
分析天平（精度0.02 g)；
SPE裝置帶抽真空系統(tǒng)：Welchrom?  SPE Device（上海本昂提供）；
黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品；
PBS 緩沖溶液：稱取1.16 g Na2HPO4，0.20 g KH2 PO4，8 g NaCl和0.2 g KCl 溶于900ml水中，用HCL或NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，然后定容至1000ml；
甲醇（色譜純）；
乙腈（色譜純）；
正己烷（分析純）。
4. 樣品前處理
牛奶樣品
1. 稱取25g(精確至0.01 g)混勻的樣品，置于50 mL具塞離心管中，水浴加熱至35℃～37 ℃，6000 r/min下離心10 min。收集全部上清液，待凈化；
2. 發(fā)酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型)
3. 稱取25 g(精確至0.01 g)混勻的樣品，用0.5mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，9500r/min下均質(zhì)5 min，水浴加熱至35℃～37 ℃，6000 r/min下離心10 min。收集全部上清液，待凈化。
4. 乳粉和粉狀嬰幼兒配方乳制品
5. 稱取10 g(精確至0.01 g)樣品置于250 mL燒杯中，加入50 mL約50 ℃的水于乳粉中，玻璃棒攪拌均勻。溶解后冷卻至室溫，移入100 mL容量瓶中，水洗燒杯并轉(zhuǎn)移洗滌液，用PBS定容至刻度后裝入離心管6000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15 min，混合上清液，取50mL上清液待凈化。
干酪
切取均質(zhì)的樣品5g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加2 mL水和30 mL甲醇，9500 r/min下勻漿5 min，超聲提取30 min，6000r/min下離心10 min。收集上清液并移入250 mL分液漏斗中，同時(shí)加入30 mL正己烷，振搖2 min，分層后，棄去正己烷層。重復(fù)用正己烷提取2次。提取液減壓濃縮至約2 mL，轉(zhuǎn)移濃縮液至離心管，燒瓶用甲醇-水溶液(1+4)5 mL分2次洗滌并倒入50 mL離心管中，加PBS溶液稀釋至50 mL，6000r/min下離心5 min，上清液待凈化。
奶油
稱取5g(精確至0.01 g)試樣，置于50 mL燒杯中，用20 mL正己烷將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇，振蕩30 min后，將全部液體移于分液漏斗中，待分層后，將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至約5 mL，加PBS稀釋至約50mL，待凈化。
5. 免疫親和柱凈化（3cc）
1. 將IAC裝于固相萃取裝置上，接上大體積上樣器，10ml PBS溶液活化柱子，流速保持在2–3 ml/min，確保上樣前柱子保留少量（0.5ml）的PBS溶液，活化液不收集；
2. 將待凈化液加入免疫親和柱，流速不超過5 mL/min，不收集流出液；
3. 用約20ml去離子水淋洗柱子，流速不超過5 mL/min，抽真空1分鐘，不收集流出液；
4. 用1.5ml甲醇洗脫，流速控制在1d/s，收集洗脫液過膜后上機(jī)測(cè)試。
注：免疫親和柱從冰箱去除需升到室溫后使用
6. 色譜條件：
色譜柱：   Ultimate? XB-C18 250 mm x 4.6 mm，5μm（上海本昂提供）
預(yù)柱：     Ultimate? C18，5μm，ULT5BG18（上海本昂提供）
流動(dòng)相：   水:甲醇:乙腈=11:4:5
柱溫：     35℃
檢測(cè)波長(zhǎng)： 發(fā)射波長(zhǎng)：365nm，激發(fā)波長(zhǎng)：450nm
進(jìn)樣量：   100μL